实验室微生物实验必知的培养制备技术汇总

　　一、要树立科学必须真实的观念，实验态度要端正。

　　要怀着一颗为了出具真实、准确，可信数据而敬畏的心去申请能力验证。

　　实验要求科学严谨,实验要预先充分练习和实践。能力验证是对实验室综合实验水平（人员，设备，环境等多因素）的评价。

　　首先要选好实验项目，找到与之配套的方法，进行充分的方法验证，从检测员能力，仪器设备性能，校检结果是否能满足实验需要，实验检测多次实验，检测环境是否进行了充分的考虑，实验确认好实验项目，认真学习标准，理解标准，并做到标准所规范的步骤，并对自己实验有了一定的信心后再去申请能力验证为宜。

　　举例：某实验室未经过充分实验方法确认，实验平时做的也少，直接申请了能力验证。实验过程生疏，照方抓药，手忙脚乱，造成稀释梯度不够，平板干燥，菌落蔓延，无法出具具体数值，实验失败。

　　二、实验室收到盲样菌株标本后，首先应做的事情利用集菌仪或者微生物检查仪制备样品。

　　1、检查标本的性状和确认包装情况，然后按照要求去能力验证网站提交收到样品情况。

　　2、仔细阅读参指导书，包括标本如何保存的信息，进行实验室内部工作分配，明确工作任务和要求。

　　3、实验前应严格按照作业指导书的要求制订检验流程，认真做好准备工作，包括实验中需要使用的器皿，须提前做好清洁灭菌。

　　三、能力验证样品处理。

　　1、定量项目，西林瓶内样品不可分割，应全部用于检测。一般参考书指导的是加40mL稀释液制成40mL样品。

　　2、定量项目样品稀释。指导书标明了稀释范围的，在稀释范围左右各加1个稀释度进行；书上没有稀释范围的，多做稀释倍数，选择合适的稀释倍数计数（一般可稀释至10-8）。

　　3、定量项目，除了要多做稀释倍数外，同时同一稀释度要多倒几皿，从原理上来讲，检测过程属于随机抽样检查，平板越多，数据越接近真值。考虑性价比，又不可能一直疯狂一个稀释度很多平板，所以能力验证时候多倒几皿，求好结果。

　　4、定性项目有一些重要步骤。

　　a、增菌及分离步骤尤其重要。选择合适的增菌液和分离用培养基对目标菌的检出非常关键，选择两种以上的增菌液和分离用培养基对菌株作直接分离和增菌后分离。

　　b、划线分离十分重要，要把增菌液中的目标菌尽量多的表达出来，要分出单个菌落并尽可能多挑取可疑菌落，确保分离到目标菌。

　　c、生化试验和血清学试验以营养琼脂平板上的纯培养细菌为好。

　　四、实验过程一定要做阴阳对照，全程空白对照。

　　再厉害的高手也有失手和看走眼的时候，所以阴阳对照就是一面镜子。对于一些荧光染色后进行判读的实验显得尤为重要。

　　这里扫盲一个误区，定量计数测菌数时，我们会认为空白就是直接取1mL无菌水然后加入到平板里，然后混菌倒皿，这是错误的。因为这样做的话，只能模拟证明稀释后倒平板这一步有没有污染。而无法证明从样品称取-样品稀释时候的污染质控情况。所以要做全程空白对照。

　　全程空白的含义就是把无菌液当成样品，然后走一遍实验过程。如果严格这么做的话，又会走向另一个极端，所以全程空白只从取样开始至稀释10-1做了简化，而不做后续稀释空白样的混菌实验。

　　在有些其他实验时候，会有样品空白以及稀释液空白，比如大气环境NOx和SO2的检测，有兴趣的可以去看看，对于全程空白的意义理解有更好的帮助。

　　五、培养基方面需要注意的地方。

　　1、培养基配制充分混匀后再灭菌。

　　正确做法是用一部分水搅拌均匀后，再加入剩余水量，混匀后灭菌或分装。

　　2、混菌法倒皿要充分混匀。

　　培养基倒完要左5圈右5圈（混匀速度一定要慢，目的是——避免培养基波动到二皿接触的缝隙部分造成后续污染），找较水平位置冷却凝固。

　　3、微生物限度过滤结束后培养基要不要覆盖问题。

　　覆盖的目的是为了阻止活菌在培养基表层通过鞭毛移动，造成片状生长，无法计数这一不利现象的发生。这里可以发挥主观能动性-对于不运动的菌，可以不覆盖，对于运动的菌覆盖。

　　总结一下：

　　a长期检测同一种样品，不覆盖并无蔓延现象，不覆盖；长期检测蔓延选择了覆盖，一直覆盖。

　　b未知样品，进行覆盖和不覆盖的比对实验，然后决定以后同样的样品是否需要覆盖。养成经验。

　　c能力验证实验，覆盖和不覆盖的都做，不要吝惜那么一点点培养基或耗材，毕竟能力验证实验做的漂亮才是实验室（是室而不是人！）能力的综合体现。

　　4、培养过程防止平皿干燥。

　　培养过程中培养基可以倒的适当厚一些，比如25mL。培养箱底部接一个不锈钢盆，装上足量无菌水（没有就去买几瓶什么的水倒里面）。

　　5、培养完成要保留实验平皿和其他相关材料。

　　作为能力验证，原始记录及实验报告还没出具完成，各种材料还是保留至数据出具后较好，便于出现问题现查原因，马上补救。

　　题外话：很多检测员等结果出了问题然后到网络上来求救，结果一问平皿已经洗掉了，那就不知道是什么状况了。有时候你问她她还会振振有词的讲：10-1，10-2都蔓延了，不洗掉干嘛，10-5，10-6没长菌，不洗掉干嘛？我当时真的无语，也不想多说话就没继续讲了。现在我回答一下这个问题：我要你一套完整梯度浓度的平皿，可以看出你10倍稀释梯度是不是稳定，还有蔓延是个什么状况，到底有多少，是一片还是局部还是很小一部分，然后根据整体数据估算结果（当然实验做成这样也基本算失败了，因为实验没有做到你可控的范围），是补救的一种（并不可取，属于垂死挣扎）。定量实验时，当天做完的稀释样品也要放冰箱里，虽然实验要求不能复检或重复检测，但作为微生物专业你是知道菌放在2-8℃下并不会长多少，如果第二天一看数据有蔓延或疑问，马上再做一次，这样也应该在误差范围内出数。

　　6、实验培养过程勤观察。

　　微生物培养过程一般需要几小时到几十小时，要利用这段时间观察培养箱及菌生长情况，比如温度是否稳定，培养室内湿度如何等等，多思多看，准备预案。方有可能得到与盲样一致的实验结果。

　　原始记录应有条理、思路清晰,完整准确地记录菌株鉴定检验的全过程,原始记录要包含时间、试验现象、试验结果三个要素，方便试验出现问题的查找。