附录Ⅻ A 无菌检查法

　　附录ⅫA无菌检查法

　　无菌检查法系用于检查药典要求无菌的生物制品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

　　无菌检查应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统应按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验还需对试验环境进行监控。

　　无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。

　　培养基

　　培养基的制备

　　培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2℃～25℃、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。

　　1.硫乙醇酸盐流体培养基

　　酪胨(胰酶水解)15.0g酵母浸出粉5.0g

　　葡萄糖5.0g氯化钠2.5g

　　L-胱氨酸0.5g新配制的0.1%刃天青溶液1.0 ml

　　硫乙醇酸钠0.5g琼脂0.75g

　　(或硫乙醇酸)（0.3 ml)水1000 ml

　　除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.1±0.2。分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2，灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。

　　2.改良马丁培养基

　　胨5.0g磷酸氢二钾1.0g

　　酵母浸出粉2.0g硫酸镁0.5g

　　葡萄糖20.0g水1000 ml

　　除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH值约为6.8，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，灭菌。

　　3.选择性培养基

　　按上述硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同验证试验。

　　4.营养肉汤培养基

　　胨10.0g氯化钠5.0g

　　牛肉浸出粉3.0g水1000 ml

　　取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。

　　5.营养琼脂培养基

　　按上述营养肉汤培养基的处方及制法，加入14.0g琼脂，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。

　　6.改良马丁琼脂培养基

　　按改良马丁培养基的处方及制法，加入14.0g琼脂，调节pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，灭菌。

　　培养基的适用性检查

　　无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。

　　无菌性检查每批培养基随机抽取不少于10支（瓶），5支（瓶）置30℃～35℃另5支（瓶）置20℃～25℃培养14天，均应无菌生长.

　　灵敏度检查

　　菌种：培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），试验用菌种应采用适宜的菌种保存技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。

　　金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B)26 003〕

　　铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC(B)10 104〕

　　枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕

　　生孢梭菌(Clostridium sporogenes)〔CMCC(B)64 941〕

　　白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F)98 001〕

　　黑曲霉(Aspergillus niger)〔CMCC(F)98 003〕

　　菌液制备接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃～35℃培养18小时～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，20℃～25℃培养24小时～48小时，上述培养物用0.9%氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100 cfu（菌落形成单位）的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基上，23℃～28℃培养5天～7天，加入3ml～5ml无菌的含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用无菌的含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100 cfu的孢子悬液。

　　菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2℃～8℃可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2℃～8℃，在验证过的贮存期内使用。

　　培养基接种取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100 cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，置30℃～35℃培养3天；取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支,分别接种小于100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，置20℃～25℃培养5天。逐日观察结果。

　　结果判定空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。

　　稀释液、冲洗液及其制备方法

　　稀释液、冲洗液配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

　　1.0.1%蛋白胨水溶液取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，调节pH值至7.1±0.2，分装，灭菌。

　　2.pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾3.56g，磷酸氢二钠7.23g，氯化钠4.30g，蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌。

　　3.0.9%氯化钠溶液取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，过滤，分装，灭菌(仅用于上述两种溶液不适用时使用)。

　　4.根据供试品的特性，可选用其他经验证过的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。

　　如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。

　　方法验证试验

　　当建立产品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若该产品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。

　　验证时，按"供试品的无菌检查"的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。

　　菌种及菌液制备同培养基灵敏度检查。

　　薄膜过滤法取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100 cfu的试验菌，过滤。将培养基加至滤筒内。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照，细菌置30℃～35℃、真菌置20℃～25℃培养3天～5天，逐日观察各滤筒内试验菌的生长情况。

　　直接接种法取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别接入小于100 cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管，取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入小于100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培养基规定量的供试品量，另1管作为对照，细菌置30℃～35℃、真菌置20℃～25℃培养3天～5天，逐日观察各滤筒内试验菌的生长情况。

　　结果判断与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证试验。

　　验证试验也可与供试品的无菌检查同时进行。

　　供试品的无菌检查

　　抽验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量（支或瓶）。成品每亚批均应进行无菌检查。除另有规定外，原液、半成品及成品按表1规定，上市产品监督检验按表2规定。

　　接种量是指每个最小包装的最少取样量（ml或g）。除另有规定外，接种供试品量按表3规定。若采用直接接种法，按接种量要求等量分别接种至硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基中（两种培养基的接种支/瓶数之比为2：1）；若采用薄膜过滤法，应采用三联薄膜过滤器，其中两联加入硫乙醇酸盐流体培养基，另一联加入改良马丁培养基。只要供试品特性允许，应将所有容器内的内容物全部过滤。

　　阳性对照以金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌。供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。阳性对照试验的菌液制备同培养基灵敏度检查项下金黄色葡萄球菌菌液制备方法，加菌量小于100cfu。阳性对照也可在供试品无菌检查培养14天后，取其中一份硫乙醇酸盐流体培养基，加入小于100cfu阳性对照菌，作为阳性对照。阳性对照置30℃～35℃培养48小时～72小时应生长良好。

　　阴性对照供试品无菌检查时，应取相应溶剂、稀释液和冲洗液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。

　　无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物生长无毒性。

　　无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。供试品的无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与验证的方法相同。

　　操作时，用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻底消毒，如果供试品容器内有一定的真空度，可用适宜的无菌器材（如带有除菌过滤器的针头）向容器内导入无菌空气，再按无菌操作起开容器取出内容物。

　　供试品处理及接种培养基

　　除另有规定外，按下列方法进行。

　　1.薄膜过滤法

　　采用封闭式薄膜过滤器，滤膜孔径应不大于0.45μm，直径约为50mm。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。

　　水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为100ml，总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。

　　水溶液供试品取规定量，装量小于10ml者，全部转移至含适宜稀释液300ml的无菌容器内，混匀，立即过滤；装量为10ml及以上者直接过滤，或全部转移至含适量稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤。如供试品具有抑菌作用或含防腐剂，须用冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于三次，所用的冲洗量、冲洗方法同方法验证试验。冲洗后，两个滤器中加入硫乙醇酸盐流体培养基各100ml，另一滤器中加入改良马丁培养基100ml。

　　水溶性固体供试品取规定量，加适宜的稀释液溶解或按标签说明复溶，然后照水溶液供试品项下的方法操作。

　　非水溶性供试品取规定量，混合溶于含聚山梨酯80或其他适宜乳化剂的稀释液300ml的无菌容器内，充分混合，立即过滤。用含0.1%～1%聚山梨酯80的冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于三次。加入含或不含聚山梨酯80的培养基。其他照水溶液供试品项下的方法操作。

　　可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和粘性油剂供试品取规定量，混合至适量的无菌十四烷酸异丙酯①中，剧烈振摇，使供试品充分溶解，如果需要可适当加热，但温度不得超过44℃，趁热迅速过滤。对仍然无法过滤的供试品，于含有适量的无菌十四烷酸异丙酯中的供试液中加入不少于100ml的稀释液，充分振摇萃取，静置，取下层水相作为供试液过滤。过滤后滤膜冲洗及加入培养基照非水溶性制剂供试品项下的方法操作。

　　无菌气（喷）雾剂供试品取规定量，将各容器置至少－20℃的冰室冷冻约1小时。以无菌操作迅速在容器上端钻一小孔，释放抛射剂后再无菌开启容器，并将供试液转移至无菌容器中，然后照水溶液或非水溶性制剂供试品项下的方法操作。

　　装有药物的注射器供试品取规定量，将注射器中的内容物（若需要可吸入稀释液或标签所示的溶剂溶解）直接过滤，或混合至含适量稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤。然后按水溶性供试品项下方法操作。

　　同时应采用直接接种法进行包装中所配带的无菌针头的无菌检查。

　　注：①无菌十四烷酸异丙酯的制备采用薄膜过滤法过滤除菌。选用孔径为0.22μm的脂溶性滤膜(140℃干热灭菌2小时)过滤。

　　2.直接接种法

　　直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品。取规定量供试品,等量分别接种至硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基中（两种培养基的接种支/瓶数之比为2：1）。除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，改良马丁培养基每管装量不少于10ml。培养基的用量和高度同方法验证试验。

　　混悬液等非澄清水溶液供试品取规定量，等量分别接种至各管培养基中。

　　固体供试品取规定量，加入适宜的稀释剂溶解，或按标签说明复溶后，混合，等量分别接种至各管培养基中。

　　非水溶性供试品取规定量，混合，加入适量的聚山梨酯80或其它适宜的乳化剂及稀释剂使其乳化，等量分别接种至各管培养基中。或等量分别直接接种至含聚山梨酯80或其它适宜乳化剂的各管培养基中。

　　培养及观察

　　将上述接种后的硫乙醇酸盐流体培养基平均分成两份，一份置30℃～35℃培养14天；另一份与接种后的改良马丁培养基置20℃～25℃培养14天，培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后、或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无菌生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中及营养琼脂斜面和改良马丁琼脂斜面培养基上，细菌培养2天、真菌培养3天，观察接种的同种新鲜培养基及营养琼脂和改良马丁琼脂斜面培养基上是否有菌生长；或取培养液（物）涂片，染色，镜检，判断是否有菌，必要时作菌种鉴定。

　　结果判断

　　阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。

　　若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少一个条件时方可判试验结果无效：

　　⑴无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。

　　⑵回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。

　　⑶供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。

　　试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。

　　表1出厂制品不同规格及原液和半成品最少抽验数量

　　供试品

　　批产量(N)；装量（V）

　　最少抽验数量

　　注射剂

　　N≤100

　　5个

　　100＜N≤500

　　10个

　　N＞500

　　20个

　　冻干血液制品

　　V＞5ml

　　每柜冻干N≤200个

　　5个

　　每柜冻干N＞200个

　　10个

　　V≤5ml

　　N≤100

　　5个

　　100＜N≤500

　　10个

　　N＞500

　　20个

　　原液或半成品

　　每个容器取样，取样量为每个容器制品总量的0.1%或不少于10ml。每开瓶一次，应如上法抽验。体外用诊断制品半成品每

　　批抽验量应不少于3ml。

　　表2上市制品监督抽验数量

　　品种及装量（V）

　　最少抽验数量

　　血液制品V＜50ml

　　6个

　　V≥50ml

　　2个

　　其他生物制品

　　10个

　　表3不同规格制品的最少接种量

　　规格

　　每支（瓶）供试品的最少接种量

　　液体制剂（ml）≤1

　　全量

　　1＜V≤5

　　半量

　　5＜V＜20

　　2ml

　　20≤V＜50

　　10ml

　　V≥50

　　半量

　　原液或半成品

　　半量

　　固体制剂＜50mg

　　全量

　　50mg≤M＜300mg

　　半量

　　300mg≤M＜5g

　　150mg

　　M≥5g

　　半量