微生物纯培养与生长量测定

　　一、微生物纯培养技术

　　微生物在自然界中不仅分布广，而且种类多，并多是混杂地生活在一起。要想研究或利用某一微生物，必须把混杂的微生物类群分离开来，以得到只含一种微生物的纯培养。微生物学中将在实验室条件下由一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为微生物的纯培养。

　　纯培养技术包括两个基本步骤：①从自然环境中分离培养对象。②在以培养对象为唯一生物种类的隔离环境中培养、增殖，获得这一生物种类的细胞群体。针对不同微生物的特点，有许多分离方法。应用最广的是平板法分离纯培养。

　　（一）、用固体培养基分离纯培养

　　单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落（colony）。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔（lawn）。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板（culture plate）的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。

　　1.稀释倒平板法（pour plate method）

　　先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1,000、1:10,000......），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。

　　2.涂布平板法（spread plate method）

　　由于将含菌材料先加到还较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，而且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落（图2-4）。

　　3.平板划线法（streak plate method）

　　用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。

　　4.稀释摇管法（dilution shake culture method）

　　用固体培养基分离严格厌氧菌有它特殊的地方。如果该微生物暴露于空气中不立即死亡，可以采用通常的方法制备平板，然后置放在封闭的容器中培养，容器中的氧气可采用化学、物理或生物的方法清除。对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法进行，它是稀释倒平板法的一种变通形式。先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右，将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱的中间。进行单菌落的挑取和移植，需先用一只灭菌针将液体石蜡--石蜡盖取出，再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间，吹入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，置放在培养皿中，用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植。

　　（二）、用液体培养基分离纯培养

　　对于大多数细菌和真菌，用平板法分离通常是满意的，因为它们的大多数种类在固体培养基上长得很好。然而迄今为止并不是所有的微生物都能在固体培养基上生长，例如一些细胞大的细菌、许多原生动物和藻类等，这些微生物仍需要用液体培养基分离来获得纯培养。

　　通常采用的液体培养基分离纯化法是稀释法。接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。如果经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。如果经稀释后的试管中有微生物生长的比例提高了，得到纯培养物的机率就会急剧下降。因此，采用稀释法进行液体分离，必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。

　　（三）、单细胞（孢子）分离

　　稀释法有一个重要缺点，它只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类，而在自然界，很多微生物在混杂群体中都是少数。这时，可以采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞（或单孢子）分离法。单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比，较大的微生物如藻类、原生动物较容易，个体很小的细菌则较难。

　　对于较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体，并在大量的灭菌培养基中转移清洗几次，除去较小微生物的污染。这项操作可在低倍显微镜，如解剖显微镜下进行。对于个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪，在显微镜下进行。目前，市场上有售的显微操作仪种类很多，一般是通过机械、空气或油压传动装置来减小手的动作幅度，在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养。在没有显微操作仪时，也可采用一些变通的方法在显微镜下进行单细胞分离，例如将经适当稀释后的样品制备成小液滴在显微镜下观察，选取只含一个细胞的液体来进行纯培养物的分离。单细胞分离法对操作技术有比较高的要求，多限于高度专业化的科学研究中采用。

　　（四）、选择培养分离

　　没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。在一种培养基上接种多种微生物，只有能生长的才生长，其它被抑制。如果某种微生物的生长需要是已知的，也可以设计一套特定环境使之特别适合这种微生物的生长，因而能够从自然界混杂的微生物群体中把这种微生物选择培养出来，尽管在混杂的微生物群体中这种微生物可能只占少数。这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离，是十分重要的，特别对于从自然界中分离、寻找有用的微生物。在自然界中，除了极特殊的情况外，在大多数场合下微生物群落是由多种微生物组成的，因此，要从中分离出所需的特定微生物是十分困难的，尤其当某一种微生物所存在的数量与其它微生物相比非常少时，单采用一般的平板稀释方法几乎是不可能分离到该种微生物的。例如，若某处的土壤中的微生物数量在10８时，必须稀释到10-6才有可能在平板上分离到单菌落，而如果所需的微生物的数量仅为10２-３，显然不可能在一般通用的平板上得到该微生物的单菌落。要分离这种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法。或抑制使大多数微生物不能生长，或造成有利于该菌生长的环境，经过一定时间培养后使该菌在群落中的数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯培养分离。

　　1.利用选择平板进行直接分离

　　主要根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件，有多种方法可以采用。例如在从土壤中筛选蛋白酶产生菌时，可以在培养基中添加牛奶或酪素制备培养基平板，微生物生长时若产生蛋白酶则会水解牛奶或酪素，在平板上形成透明的蛋白质水解圈。通过菌株培养时产生的蛋白质水解圈对产酶菌株进行筛选，可以减少工作量，将那些大量的非产蛋白酶菌株淘汰；再如，要分离高温菌，可在高温条件进行培养；要分离某种抗菌素抗性菌株，可在加有抗菌素的平板上进行分离；有些微生物如螺旋体、粘细菌、蓝细菌等能在琼脂平板表面或里面滑行，可以利用它们的滑动特点进行分离纯化，因为滑行能使它们自己和其它不能移动的微生物分开。可将微生物群落点种到平板上，让微生物滑行，从滑行前沿挑取接种物接种，反复进行，得到纯培养物。

　　2.富集培养

　　主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。富集条件可根据所需分离的微生物的特点从物理、化学、生物、及综合多个方面进行选择，如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等等许多方面。如采用富集方法从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验过程。首先配制以对羟基苯甲酸为唯一碳源的液体培养基并分装于烧瓶中，灭菌后将少量的土壤样品接种于该液体培养基中，培养一定时间，原来透明的培养液会变得浑浊，说明已有大量微生物生长。取少量上述培养液转移至新鲜培养液中重新培养，该过程经数次重复后能利用对羟基苯甲酸的微生物的比例在培养物中将大大提高，将培养液涂布于以对羟基苯甲酸为唯一碳源的琼脂平板，得到的微生物菌落中的大部分都是能降解对羟基苯甲酸的微生物。挑取一部分单菌落分别接种到含有及缺乏对羟基苯甲酸的液体培养基中进行培养，其中大部分在含有对羟基苯甲酸的培养基中生长，而在没有对羟基苯甲酸的培养基中表现为没有生长，说明通过该富集程序的确得到了欲分离的目标微生物。通过富集培养使原本在自然环境中占少数的微生物的数量大大提高后，可以再通过稀释倒平板或平板划线等操作得到纯培养物。

　　富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之一。营养和生理条件的几乎无穷尽的组合形式可应用于从自然界选择出特定微生物的需要。富集培养方法提供了按照意愿从自然界分离出特定已知微生物种类的有力手段，只要掌握这种微生物的特殊要求就行。富集培养法也可用来分离培养出由科学家设计的特定环境中能生长的微生物，尽管我们并不知道什么微生物能在这种特定的环境中生长。

　　（五）、二元培养物

　　分离的目的通常是要得到纯培养。然而，在有些情况下这是做不到的或是很难作到的。但可用二元培养物作为纯化培养的替代物。只有一种微生物的培养物称为纯培养物，含有二种以上微生物的培养物称为混合培养物，而如果培养物中只含有二种微生物，而且是有意识的保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。例如二元培养物是保存病毒的最有效途径，因为病毒是细胞生物的严格的细胞内寄生物。有一些具有细胞的微生物也是严格的其它生物的细胞内寄生物，或特殊的共生关系。对于这些生物，二元培养物是在实验室控制条件下可能达到的最接近于纯培养的培养方法。

　　在自然环境中，猎食细小微生物的原生动物也很容易用二元培养法在实验室培养，培养物由原生动物和它猎食的微生物二者组成。例如，纤毛虫、变形虫和粘菌。对这些生物，二者的关系可能并不是严格的。这些生物中有些能够纯培养，但是其营养要求往往极端复杂，制备纯培养的培养基很困难、很费事。

　　二、微生物生长量的测定

　　微生物学研究中常常要进行微生物生长量的测定，有多种方法用于微生物生长量的测定，概括起来常用的有以下几种：

　　（一）直接计数法(又称全数法)

　　1、计数器直接测数法

　　取定量稀释的单细胞培养物悬液放置在血球计数板(细胞个体形态较大的单细胞微生物，如酵母菌等)或细菌计数板(适用于细胞个体形态较小的细菌)上，在显微镜下计数一定体积中的平均细胞数，换算出供测样品的细胞数。

　　（1）血球计数板及细胞计数

　　血球计数板是一种在特定平面上划有格子的特殊载片。在划有格子的区域中，有分别用双线和单线分隔而成的方格。其中有以双线为界划成的方格25(或16)格，这种以双线为界的格子称为中格，其内有以单线为界的16（或25）小格。因此，用于细胞计数的区域的总小格数为：25×16=400。该400个小格排成一正方形的大方格，此大方格的每条边的边长为1 mm，故400个小格的总面积为1mm２。

　　在进行细胞计数前，先取盖玻片盖于计数方格之上，盖玻片的下平面与刻有方格的血球计数板平面之间留有0.1mm高度的空隙。含有细胞的供测样品液被加注在此空隙中。加注在400个小格（1mm２）之上与盖玻片之间的空隙中的液体总体积应为：1.0mm×1.0mm×0.1mm=0.1mm３

　　一般表示样品细胞浓度的单位为：亿个/mL。因此，在计数后，获得在400个小格中的细胞总数，再乘以10４，以换算成每mL所含细胞数。其计算公式如下：

　　菌液的含菌数/mL=每小格平均菌数×400×10 000×稀释倍数

　　在进行具体操作时，一般取五个中格进行计数，取格的方法一般有两种：①取计数板斜角线相连的5个中格；②取计数板4个角上的4个中格和计数板正中央的1个中格。对横跨位于方格边线上的细胞，在计数时，只计一个方格4条边中的2条边线上的细胞，而另两条边线上的细胞则不计；取边的原则是每个方格均取上边线与右边线或下边线与左边线。

　　图3—5血球计数板方格示意图

　　（2）细菌计数板及细胞计数

　　细菌计数板与血球计数板结构大同小异，只是刻有格子的计数板平面与盖玻片之间的空隙高度仅0.02mm。因此，计算方法稍有差异（见以下计算公式），余者与血球计数板法同。

　　菌液样本的含菌数/mL=每小格平均菌数×400×50 000×稀释倍数

　　2、涂片染色计数

　　用计数板附带的0.01mL吸管，吸取定量稀释的细菌悬液，放置刻有1 cm２面积的玻片上，使菌液均匀地涂布在1cm２面积上，固定后染色，在显微镜下任意选择几个乃至十几个视野来计算细胞数量。根据计算出的视野面积核算出每1cm２中的菌数，然后按1cm２面积上的菌液量和稀释度，计算每mL原液中的含菌数。

　　原菌液的含菌数/mL=视野中的平均菌数×1cm２/视野面积×100×稀释倍数

　　3、比浊法

　　这是测定菌悬液中细胞数量的快速方法。其原理是菌悬液中的单细胞微生物，其细胞浓度与混浊度成正比，与透光度成反比。细胞越多，浊度越大，透光量越少。因此，测定菌悬液的光密度(或透光度)或浊度可以反映细胞的浓度。将未知细胞数的悬液与已知细胞数的菌悬液相比，求出未知菌悬液所含的细胞数。浊度计、分光光度仪是测定菌悬液细胞浓度的常用仪器。此法比较简便，但使用有局限性。菌悬液颜色不宜太深，不能混杂其他物质，否则不能获得正确结果。一般在用此法测定细胞浓度时，应先用计数法作对应计数，取得经验数据，并制作菌数对OD值的标准曲线方便查获菌数值。

　　（二）活菌计数法(又叫间接计数法)

　　活菌计数法又称间接计数法。直接计数法测定到的是死、活细胞总数，而间接计数法测得的仅是活菌数。这类方法所得的数值往往比直接计数法测得的数值小。

　　1、平板菌落计数

　　此法是基于每一个分散的活细胞在适宜的培养基中具有生长繁殖并能形成一个菌落的能力；因此，菌落数就是待测样品所含的活菌数。

　　将单细胞微生物待测液经10倍系列稀释后，将一定浓度的稀释液定量地接种到琼脂平板培养基上培养，长出的菌落数就是稀释液中含有的活细胞数，可以计算出供测样品中的活细胞数。但应注意，由于各种原因，平板上的单个菌落可能并不是由一个菌体细胞形成的，因此在表达单位样品含菌数时，可用单位样品中形成菌落单位来表示，即CFU／mL或CFU／g(CFU即colony-forming unit)。

　　2、液体稀释最大或然数法测数

　　取定量（1mL）的单细胞微生物悬液，用培养液作定量10倍系列稀释，重复3－5次，将不同稀释度的系列稀释管置适宜温度下培养。在稀释度合适的前提下，在菌浓度相对较高的稀释管内均出现菌生长，而自某个稀释度较高的稀释管开始至稀释度更高的稀释管中均不出现菌生长，按稀释度自低到高的顺序，把最后三个稀释度相对较高的、出现菌生长的稀释管之稀释度称为临界级数。由3至5次重复的连续三级临界级数获得指数，查相应重复的最大或然数(即most probable number，MPN)表求得最大可能数，再乘以出现生长的临界级数的最低稀释度，即可测得比较可靠的样品活菌浓度。

　　在实践中，通常以5管重复为一个组，故这里仅列出5次重复测数统计表。只要知道了数量指标，就可查知近似值。

　　3薄膜过滤计数法

　　测定水与空气中的活菌数量时，由于含菌浓度低，则使用微生物限度检测仪可先将待测样品(一定体积的水或空气)通过微孔薄膜(如硝化纤维薄膜)过滤浓缩，然后把滤膜放在适当的固体培养基上培养，长出菌落后即可计数。

　　（三）细胞物质量测定法

　　1、干重法

　　集菌仪过滤定量培养物用离心或过滤的方法将菌体从培养基中分离出来，洗净、经常压或真空干燥，干燥温度常采用105℃、100℃或红外线烘干至恒重，也可在较低温度（80℃或40℃）下真空干燥，然后精确称重，即可计算出培养物的总生物量。过滤时丝状真菌用滤纸过滤，细菌用醋酸纤维膜等进行过滤。一般细菌干重约为湿重的20％～25％。此法直接而又可靠，但要求测定时菌体浓度较高，样品中不含非菌体的干物质。

　　2、含氮量测定法

　　细胞的蛋白质含量是比较稳定的，可以从蛋白质含量的测定求出细胞物质量。已知细菌细胞干重的含氮量一般为12%～15％，酵母菌为7.5％，霉菌为6.0％。一般细菌的含氮量约为原生质干重的14％。而总氮量与细胞蛋白质总含量的关系可用下式计算：

　　蛋白质总量=含氮量百分比×6.25

　　3、DNA测定法

　　这种方法是基于DNA与DABA—2HCl(即新配制的20％W／W，3,5—二氨基苯甲酸-盐酸溶液)结合能显示特殊荧光反应的原理，定量测定培养物的菌悬液的荧光反应强度，求得DNA的含量，可以直接反映所含细胞物质的量。同时还可根据DNA含量计算出细菌的数量。每个细菌平均含8.4×10－５ng DNA。

　　4、其他生理指标测定法

　　微生物新陈代谢的结果，必然要消耗或产生一定量的物质。因此也可以用某物质的消耗量或某产物的形成量来表示微生物的生长量。例如通过测定微生物对氧的吸收、发酵糖产酸量或CO２的释放量，均可用来作为生长指标。使用这一方法时，必须注意作为生长指标的那些生理活动，应不受外界其他因素的影响或干扰，以便获得准确的结果。

　　从上表中可以看出，每种方法都各有优点和局限性。只有在考虑了这些因素同需要着手解决的问题之间的关系以后，才能对具体的方法进行选择。正如前面说过的，平皿菌落计数法是微生物学中应用最多的常规方法，掌握这一方法的原理和实际操作，很有必要。此法在理论上能反映活菌数。另外当用两种不同的方法测量细菌的生长量时，其结果不一致是完全可能的。

　　测定微生物的生长量，在理论和实践上都十分重要。当我们要对细菌在不同培养基中或不同条件下的生长情况进行评价或解释时，就必须用数量来表示它的生长。例如可以通过细菌生长的快慢来判断某一条件是否适合。生长快的细胞，最终的总收获量可能没有另一些条件下的收获量大。在另一些条件下，生长速率虽然较低，但它却可在一段时间内不断增加。因此，只有具备了有关生长的定量知识，才能在实际应用中作出正确的选择，以利于科研和生产活动的进一步开展。